現代顯微成像技術的基石，建立在去除熒光在樣品中的散射技術上，典型如共聚焦、多光子、光片成像、三維結構光、組織透明化等。然而，基于光學的層切技術常常會帶來系統成本、成像時間與光毒性的提高，基于生物的層切技術又會帶來樣品處理復雜性的提高。此外，即使是最先進的光學成像技術，在面對深層樣本的成像中，依然會由于深層散射而產生離焦背景，影響精細生物結構的觀察。
為了提升各種場景下熒光成像的光學層切性能，我院生物醫學光子學研究中心屈軍樂/北京大學席鵬合作團隊另辟蹊徑，通過計算機視覺與熒光顯微的融合提出了一種暗通道光學層切算法（Dark sectioning），相關成果在Nature Methods雜志以長文（Article）的形式發表，題為“暗通道光學層切算法助力熒光圖像離焦背景去除”的研究論文。Dark sectioning僅用單幀圖像即可高效去除圖像的離焦背景，使顯微成像的信背比（SBR）和結構相似性（SSIM）得到大幅提升，為深部生物組織研究、病理診斷及深層活體動態觀測開辟全新可能。
研究背景：離焦信號成顯微成像“攔路虎”
熒光顯微鏡雖能捕捉細胞動態，但樣本散射或離焦區域產生的背景噪聲會掩蓋關鍵細節。傳統解決方案如共聚焦顯微鏡、結構光成像等技術雖有效，卻需復雜硬件或犧牲成像速度；而現有算法（如去噪、反卷積）難以精準區分焦點內外信息，易導致弱信號丟失或產生圖像偽影。
核心技術：靈感來自“圖像去霧”，單幀實現高精度光學切片
研究者從自然圖像的暗通道去霧中獲得靈感，融合暗通道先驗與雙頻分離原理（圖1）：
暗通道先驗：聚焦區域的暗通道值趨近于零，而離焦背景呈現非零波動，借此精準區分焦點內外信息，廣泛應用于自然圖像去霧任務中。
雙頻分離：將圖像分解為高頻（細節）和低頻（背景）成分，僅處理低頻部分以保留弱信號，最終融合生成高質量圖像。
圖1.（a, b）自然圖像與離焦圖像的暗通道先驗處理結果，（c）點拓展函數的大小差異導致暗通道圖像差異，以及（d）Dark sectioning處理前后的圖像對比。比例尺：4 μm。
首先，通過雙頻分離以保留圖像的弱小信號，僅對圖像的低頻部分進行背景去除，并利用點擴展函數優化圖像塊尺寸，采用更低一級的低通濾波器模擬初始背景，最后通過單次或多次迭代去除背景以適用不同的成像場景。通過寬場-共聚焦，寬場-光層切，二維-三維結構光，單光子-雙光子的聯合交叉驗證（圖2），結果表明，Dark sectioning技術將SBR提升近10 dB，SSIM提高約10倍，效果媲美共聚焦顯微鏡，且適用于寬場、雙光子、光片顯微鏡等多種成像模式，甚至能優化現有算法（如去卷積、超分辨成像），減少偽影。
圖2.交叉驗證證明Dark sectioning技術的保真性能。（a）霉菌樣本的寬場-共聚焦成像，（b）小鼠腎臟微絲的多模態結構光照明顯微成像，（c）小鼠神經元鈣成像的單光子-雙光子成像。比例尺：（a, b）4 μm。
應用場景：從腦科學到病理診斷的突破
Dark sectioning技術可應用于不同的生物醫學成像場景。在神經科學中，識別被背景掩蓋的小鼠腦組織深層神經元，助力腦活動追蹤。在病理分析中，對200微米厚的前列腺病理切片，精準分割600多個細胞核，遠超傳統方法的200個，為癌癥診斷提供更清晰依據動態觀測。此外，支持活細胞長時間成像，實時捕捉內質網、線粒體等動態過程，且無需復雜硬件升級（圖3）。
圖3. Dark sectioning的典型應用。（a）基于光片的小鼠全腦成像，（b）小鼠血管的小動物活體成像，（c）合成孔徑雙光子小鼠神經元成像，（d）前列腺組織三維光片成像與虛擬染色圖像。比例尺：（a）40 μm，（b）2 mm，（c）32 μm，（d）8 μm。
研究意義：低成本、高兼容，推動精準醫學發展
Dark sectioning技術打破了傳統顯微成像在速度、成本與精度間的權衡，它像一款“智能濾鏡”，可無縫整合到現有設備中，為生物醫學研究提供更經濟高效的解決方案。目前，研究團隊已開源代碼、提供了MATLAB程序/函數，基于Java的Fiji插件（https://github.com/Cao-ruijie/Dark-sectioning）供不同用戶測試使用，推動技術普及。未來，該技術或與深度學習結合，進一步革新醫學圖像分析，為疾病機制研究和臨床診斷開辟新路徑。
在本項工作中，北京大學未來技術學院教授席鵬、深圳大學物理與光電工程學院教授屈軍樂為該論文的共同通訊作者，北京大學未來技術學院博士生曹睿杰和北京大學未來技術學院已畢業的李雅寧博士為共同第一作者，深圳大學生物醫學光子學研究中心林方睿、張煒參與了本工作。此外，該工作還得到了華中科技大學費鵬課題組、清華大學吳嘉敏課題組、南方科技大學李依明課題組、北京大學李長輝課題組、北京大學盧閆曄課題組的重要支持與幫助。
本工作得到了科技部重點研發專項、國家自然科學基金等項目的資助。
論文信息：Cao, R., Li, Y., Zhou, Y. et al. Dark-based optical sectioning assists background removal in fluorescence microscopy. Nat Methods (2025).https://doi.org/10.1038/s41592-025-02667-6
